T5核酸外切酶沿5´→3´方向降解DNA，既能从线性或切刻双链DNA（dsDNA）的5′ 末端起始消化，也能从线性或环状双链DNA（dsDNA）的缺口或切刻处起始消化。然而该酶不会降解超螺旋双链DNA（dsDNA）。T5核酸外切酶还具有单链DNA（ssDNA）核酸内切酶活性。

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