引加生物的核酸外切酶III（Exonuclease III）来源于大肠杆菌的Exo III基因，并在大肠杆菌中表达并分离纯化得到。该酶能作用于双链DNA，沿3´-OH 末端逐步释放5'-单磷酸核苷酸，产生ssDNA片段。每次酶与底物结合催化时，只有少量核苷酸被去除，从而在DNA分子群内产生渐进缺失。此外，该酶对ssDNA、硫代磷酸酯连接的核苷酸无活性。

尽管该酶也可作用于双链DNA的切刻以产生单链缺口，但其最适底物是平末端的dsDNA或3´ 末端凹陷的dsDNA。该酶无法切割3´ 突出末端；抗切割程度随突出末端的长度而变化，四碱基或更长的突出末端则完全不能被切割。

该酶的活性部分依赖于DNA的螺旋结构，并表现出序列依赖性（C>A=T>G）。温度、盐浓度和酶与DNA的比例对酶活性影响很大，需要根据特定应用调整反应条件。

Exo III还具有以下三种酶活性：

3'-磷酸酶活性：切除3'-末端的磷酸基团，产生3'-OH基团；

RNase H活性：外切核酸酶活性，降解RNA-DNA杂合体中的RNA链；

AP-内切核酸酶活性：切割脱嘌呤或脱嘧啶位点(AP位点)的磷酸二酯键，产生5'-端无碱基的脱氧核糖5'-磷酸残基。

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